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細胞培養中污染的預防與清除

點擊次數:302   發布時間:2020/1/9 9:27:37

    細胞培養中污染的預防與清除

     一、污染的預防
    預防是防止細胞培養過程中發生污染的zui好辦法。只有預防工作做在前,才能將發生污染的可能性降到zui小程度。一般預防可從以下幾方面著手:

    (一)從操作者做起
    1、操作者責任心要強,要細心穩重,操作技術要熟練。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘,按規定穿隔離衣。進入后關好門,坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養物,不要把污染品或未經消毒的物品帶入無菌室內,更不能隨便使用,以免造成大批污染。

    2、操作者動作要輕,必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口,并將瓶口轉動燒灼。操作時盡量不要談話,若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。

    3、操作時要常更換吸管,切勿一根吸管做到底。一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢及時收拾,保持實驗室清潔整齊,zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

    (二)從物品、用品消毒滅菌著手
    細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底,各種溶液滅菌除菌要仔細,并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

    (三)防止細胞交叉污染
    在進行多種細胞培養操作時,所用器具要嚴格區分,zui好做上標記便于辨別。并按順序進行操作,避免一起進行時易發生混亂。

    在進行換液或傳代操作時,注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口,以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞。

    所有細胞一旦購置,或從別處引入,或自己建立,均應及早留種凍存,一旦發生污染可棄之復蘇,重新培養。

    二、污染的清除
    培養細胞一經污染,多數較難處理。如果污染細胞價值不大,宜棄之;有細胞株留存的或可購置的,可在尋找原因后徹底消毒操作室,復蘇或重新購置細胞,再培養。若污染細胞價值較大,又難于重新得到,可采取以下辦法清除。

    (一)使用抗生素
    抗生素對殺滅細菌較有效。聯合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。預防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL),污染后清除用藥需采用大于常用量5~10倍的沖洗法,于加藥后作用24~48小時,再換常規培養液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外,還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環素、制霉菌素等。常用400~800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環素處理,每隔2~3日換液1次,傳1~2代進行治療。近年來有報道,4-氟,2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環素衍生物(BM-2)等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250X濃縮液,-20℃保存備用,使用濃度Cip為10μg/mL,BM-1為10μg/mL,BM-2為5μg/mL。使用時先吸除污染的培養液,加入含BM-1的RPMI1640培養液,3天后再吸除培養液,加入含BM-2的RPMI1640培養液,培養4天,如此連續3個輪次,直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后,再加正常培養液培養傳代3-4次。

    (二)使用支原體特異性血清
    用5%的兔支原體免疫血清(血凝效價1:320以上)可去除支原體污染,因特異抗體可抑制支原體生長,故經抗血清處理后11天即轉為陰性,并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩,不如用抗生素方便、經濟。

    (三)加溫處理
    將污染的組織培養物放在41℃培養18小時,可殺死支原體,但對細胞有不良影響。所以在處理前要進行預試驗,摸索能zui大限度殺死支原體又對細胞影響zui小的加熱時間。此法有時不可靠。若先用藥物處理后,再以41℃加溫處理效果更佳。

    (四)其他方法
    除了上述去除污染的方法外,還有動物體內接種除菌法、巨噬細胞吞噬法、污染培養瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等,但均較麻煩,且效果不確定。所以一旦支原體污染,除非有特別重要價值,一般均棄之重新培養。

原創作者:上海恒遠生物科技有限公司

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